大学课件之食品微生物学第二章(6)

Biofilm:不同的研究方向食品中主要的芽孢菌芽孢形成芽孢结构芽孢的抗性芽孢萌发过程,第三节食品微生物生态学,Whatecologicalinformationisneeded在食品生产的每一阶段–从原料到餐桌，微生物分布的可靠数据。生产过程和零售期菌株的生长周期和数量变化的数据。在食品中这些微生物的空间分布信息。微生物在食品中存活全过程的生化和生理学解释。内部的、外部的、加工的和不明的因子对微生物生长、存活和生物化学活性的影响。单独生物的生长和产量、产品质量及安全的关系。InternationalJournalofFoodMicrobiology50(1999)101–117,人体肠道元基因组计划（MetaHIT）MetaHITisaprojectfinancedbytheEuropeanCommissionunderthe7thFPprogram.Theconsortiumgathers13partnersfromacademiaandindustry,atotalof8countries.Itstotalcosthasbeenevaluatedatmorethan21,2million€.Theprojectwilllastfor4yearsfromJanuary1,2008.Objectives:Genesofintestinalmicrobes,humanhealthanddisease.http://www.metahit.eu,人体肠道元基因组计划（MetaHIT）人类肠道中的菌群可能拥有几百万个基因，细菌整体拥有的基因组远远多于人类自身，肠道系统可被视作人类的“第二基因组”。对这些基因进行了详细分析，相关结果将有助于肠道疾病的研究和治疗。人类肠道中有60%80%的微生物是不能够通过培养进行研究的。病从口入2010.03.04,Nature封面,慢性病的肠源性学说在人体中，人的细胞数仅占细胞总量的10%，而共生微生物的细胞比例高达90%。共生细菌大部分生活在肠道里，有约1.5kg。其代谢物可以进入血液，影响人的健康。有益菌可以产生消炎、镇痛、抗氧化的物质，还可合成维生素、氨基酸、丁酸盐等营养成份，对人体有滋养和保护作用。有害菌则可以产生神经毒素、致癌物质和游离抗原，进入血液后能够引起儿童自闭症、老年痴呆、肥胖症、糖尿病、冠心病、甚至癌症等各种慢性病。JournalofBiotechnology,益生菌对肠道微生物生态学影响抗生素作为饲料添加剂的大量使用，在抑制和杀灭病原菌的同时也抑杀了动物机体内正常共生的菌群，破坏了微生态平衡。一些需氧菌，大部分为肠杆菌科和链球菌属类细菌的增加，及双歧杆菌和梭状芽孢杆菌属的减少会造成肠道微生物失调。益生菌：通过摄取适当的量、对食用者的身体健康能发挥有效作用的活菌(FAO、WHO，2001年)。益生菌的作用在于扶植正常微生物菌群,拮抗病原菌，把生态失衡调节为生态平衡。,益生菌对动物肠道生态系统的影响及作用机制抑制肠道病原菌的作用定植黏附作用产生抑制病原菌的代谢产物产生酸性物质、细菌素、过氧化氢、诱导酶和双乙酰对肠道的营养作用增强免疫力,肠道菌群失调症与肠道微生态改变有关的临床疾病主要有糖尿病、肥胖、炎症性肠病(IBD)、肠易激综合征（IBS）、非酒精性脂肪肝、胃炎、十二指肠溃疡、心血管疾病、胃肠道癌症等；肥胖及其相关的代谢疾病如糖尿病和代谢综合征与肠道菌群多样性降低有关，并伴有拟杆菌(Bacteroides)含量的下降和肠球菌、乳杆菌含量的增加。IBD病因至今未明，存在着明显的肠道菌群失衡。以腹泻为主的IBS病人出现了乳酸杆菌含量的下降，而以便秘为主的IBS病人则出现了韦荣球菌含量的增加。幽门螺杆菌感染是慢性消化性溃疡发生发展的重要因素之一。,肠道生态系统失调的原因外源:抗生素的使用、老龄化、外科手术、肝肾病、放射治疗、化学治疗、免疫系统失调以及应激等;内源日粮改变、营养水平变化、胃肠道pH改变、腹泻、细菌的拮抗、黏液素、融解酵素、抵御素的分泌等。益生元：能在大肠中调整菌群的食品(Gibson,1995)，双歧因子合生元：益生菌和益生元的组合制剂，或再加入维生素、微量元素等。,在肥胖的人的肠道里和接受实验的体重超标的白鼠的肠道里，一族被称为“拟杆菌”的细菌含量都明显偏少，而一族被称为“厚壁菌”的细菌含量则明显偏多。,Thegutmicrobiotaasanenvironmentalfactorthatregulatesfatstorage.PNAS101(44):15718-15723Host-BacterialMutualismintheHumanIntestine.Science.2005.307:1915-1920.Microbialecology:Humangutmicrobesassociatedwithobesity.Nature.2006.444:1022-1023.肥胖者消化道内，拟杆菌的含量只有3%。而当这些人通过节食，使体重恢复正常后，他们消化道内拟杆菌的含量接近了15%。,转基因食品的担忧农作物的生物多样化的损失，生态平衡的干扰对人体肠道菌群的影响生物系统是非常复杂的，无论是从分子水平、细胞水平、组织器官水平、个体水平、生态水平各个横向层次上，还是纵向联系上讲，都存在着复杂的“裙带”关系，牵一发而动全局。转基因专家们研究的都是细微的局部问题，即使别的方面的专家参与进来，也不可能完全弄清楚推广转基因作物造成的后果。丢失一个钉子，坏了一只蹄铁；坏了一只蹄铁，折了一匹战马；折了一匹战马，伤了一位骑士；伤了一位骑士，输了一场战斗；输了一场战斗，亡了一个帝国。,2.Limitationsofmethodology食品中总的微生物或单个的微生物检测：样品混合→匀浆稀释→稀释液倒平板→菌落分离和鉴定。对菌落含量低(如<100–500cfu/g)的菌株需要预增菌或选择性增菌。该法长期以来一直使用且取得了较大的成功，但也存在一定的局限性。微生物生态系统由于其结构和功能的多样性和复杂性，常被喻为“黑箱”。传统微生物生态学研究主要以微生物分离培养为前提，其局限性使之在全面揭示这个“黑匣子”的全部结构、功能及其相互关系等信息方面显得束手无策。,浸渍Maceration浸渍后的组织提取物可能对某些微生物有毒或有抑制作用，因此可能会导致对天然产物的生态学组成产生错误的结果。植物、草药和核素可能会对一些微生物有毒。,稀释Dilution？稀释物的组成和稀释及涂计数平板的时间很重要。常用0.1%的蛋白胨作为细菌计数标准稀释物。对酵母和霉菌而言，用蒸馏水、盐溶液、磷酸缓冲液和0.1%的蛋白胨作为稀释物。稀释液不同，结果也不同。食品真菌学国际委员会(TheInternationalCommissiononFoodMycology)曾组织国际合作想对食品中酵母的稀释方法标准化，但发现酵母对任何一种稀释剂的结果都不稳定。结论：除了上述两因素外，其它如细胞生活周期、稀释前的细胞应力、细胞聚合度、摇动时的剪切应力、杂质金属离子、稀释时的pH和温度等，会影响酵母细胞的存活。且上述因素同样对细菌和丝状真菌有影响。,Enrichmentcultures富集培养常用来对劣势微生物进行增殖和检测，特别是病原菌。可由1cfu/25g增至105–106cfu/ml，从而进行平板计数、ELISA或PCR，以防出现假阴性。富集培养的生长动力学是由许多因素决定的，如培养基的组成、培养的时间及温度、通风、食品中其它成分的干扰、非目标菌的竞争、抗菌素的影响和亚致死程度等。,Anaerobes许多重要的厌氧微生物在生态学研究时并没有被真正的注意到；一些食品中(如啤酒)陆续发现新的严格厌氧的微生物。,Unknownandnon-culturablespecies平板培养仅能发现1-10%或更少的环境微生物。新的未知的，按现有方法不能培养；已知但处于非培养状态。从生态系统中提取总的DNA，但对新鲜产品(如果蔬、肉类)和复杂的发酵产品(如霉菌发酵奶酪、香肠等)，因生物多样性，可能很难完全了解其微生物组成。,Quantitativedata微生物细胞的数量最终会决定是否会爆发疾病或使风味丧失。数量非静态的，而是在生产和销售链中会有量和质的变化。生态学数据必需将食品生态系统中微生物的动态性质考虑进去。在许多产品中，会连续发生微生物种或菌株的变化，生态系统中的每一种微生物因其生化活性会对其化学组成有影响。对公共健康和腐败风险的可靠评价需要考虑动态变化。,Limitations许多研究仅仅描述在产品某一“历史时期”“最优势菌”的分离和鉴定，有些研究则报道了某些特殊生物出现频率的半定量数据。离心倒平板技术避免了培养富集，使细胞最低检测限达到1cfu/25g样品。这一方法可快速得到定量数据，也显示了富集法的劣势。,3.Eco-biochemistryandphysiology生态生物化学和生理学食品生态体系中微生物的生长需要生物化学和生理学的解释以理解许多食品中微生物生长带来的生物化学变化及食品性质的改变。但现有的研究多是基于纯培养，需要更多的注意力来描述有许多不同生理状态的细胞的独特的现场环境(in-situ)，如生长的、不生长的、死亡的和自溶的。在许多食品微生物体系中，现场环境是指微生物细胞和固体基质因吸附或包埋或两者兼备。基本上细胞是被高密度固定化，它们的生存、生长、对极端环境的耐受、生物化学活性甚至细胞的组成都可能与游离状态不同。,生态生物化学和生理学营养和终产物的累积：有的食品可能货架寿命会很长，营养的限制(S、P、微量金属和维生素)和终产物的累积会导致微生物从对数生长期向稳定期的转变。营养的吸收：在酒精饮料的发酵过程中，糖转运至酵母细胞是很重要的限速反应。微生物自溶是一个非常重要的原位(in-situ)现象(营养、抑制、风味)。,4.食品生境食品生境的不均一性五花肉固态发酵的料醅大孔隙、毛细管孔隙表面环境和生物膜,Spatialheterogeneity一般而言，大多数食品提供一个物理结构和化学组成不同的环境。因此微生物在食品中的生长存在空间上的差异。不同的部位可能会存在不同的微生物。切割后的果蔬和保留完整果皮或蜡层的果蔬表面，或者肉制品、奶制品的表面和内部的微生物生态可能不同。研究某一微生物是否在整个产品中存在很重要。利用具有荧光标记的抗体或核酸探针，用荧光显微镜和共焦扫描激光显微镜联合检测，能发现特殊微生物的原地定位。该技术发现大肠杆菌0157:H7不仅仅附在萝卜苗或生菜叶的外表面，因为它在切割面及气孔和其它组织的内部被发现。,美国25个州召回疑被大肠杆菌(O－145型)污染生菜（romainelettuce）。受污染生菜产自亚利桑那州尤马地区的一家农场，由俄亥俄州悉尼鲜维食品公司（FreshwayFoodsofSidney）经销。加拿大食物检验局：生菜沙拉含大肠杆菌回收美国Dole食品公司的HeartDelight品牌的生菜沙拉包可能受到0157:H7大肠杆菌污染。这种即拌生菜包括混合罗马生菜(romainelettuce)、绿叶生菜(greenleaflettuce)和奶油生菜(butterlettuce)。,Lebensm.-Wiss.u.-Technol.,35,720–729(2002),5.Microbialinteractions中性、偏利、互利、共生、偏害、竞争、寄生、捕食AB无影响无影响AB有利无影响AB有利有利AB有害有害AB有害有利AB有害无影响,群落演变在一个生态区域中，由于某种内外环境因素的改变，原有的微生物群落经过一定时期后，被另一种新的生物群落所取代的现象。Whendiscussingtheshelflifeoffooditmustbedonefromanecologicalviewpoint.,6.Diversityinthemicrobialecologyoffoods–casestudies两点结论：尽管原理相同，但大多数食品的微生物生态是不同的，且比预想的复杂。在研究方面还有一些盲区。,7.MicrobialMolecularEcologyTechniques用于研究微生物群落结构组成和功能的分子生态学技术，主要包括克隆文库分析遗传指纹图谱分析探针杂交技术磷脂脂肪酸标记(PLFAlabeling)稳定同位素探测(SIP)等。,天然多菌种混合发酵工艺菌种的不稳定产品的质量受外界因素的影响,采用纯培养和不依赖纯培养(PCR-DGGE,denaturinggradientgelelectrophoresis)的技术对墨西哥发酵玉米团的微生物组成和分布进行研究，发现在发酵过程中乳酸菌处于统治地位，占90%～97%。其分泌的淀粉酶将淀粉分解成糖类物质，进而分解成乳酸及其盐类物质，保证发酵的顺利进行。,MicrobiologicalandchemicalpropertiesofkefirmanufacturedbyentrappedmicroorganismsisolatedfromkefirgrainsJournalofDairyScience,92(7),2009,3002-3013,8.奶酪生产过程的微生物生态(例)包括食品微生物生态各方面的问题，如发酵、腐败、安全、生物控制、益生素及基因改良菌株在食品中的应用。BriecheesesGruyerecheeses,奶酪生产工艺原料乳标准化杀菌、冷却凝乳加发酵剂调整酸度加CaCl2加色素加凝乳剂凝块切割搅拌热　烫排出乳清成型压榨盐渍上色挂蜡成　熟,Microbiologyofmilkfermentation奶巴氏杀菌后加入106cfu/ml或更多的乳酸菌，凝乳中更是高达109–1010cfu/g。乳酸、细菌素和其它抗菌物质，预防腐败和病原微生物生长。在此期间，主要的生态学问题是如何预防细菌素抑制乳酸菌，从而妨碍发酵。了解发酵过程中，生物化学、生理学和分子生物学方面的变化，尤其是乳糖如何产生乳酸和对奶酪的风味和质构有影响的物质。,Microbiologyofmaturation奶酪，尤其是软/半软奶酪中有高达109–1010cfu/g非乳酸菌发酵剂的微生物，被称为次级微生物或外来微生物。但对成熟有重要作用。次级微生物还是细菌、酵母、霉菌和细菌素等的混合物。是否巴氏杀菌、是否添加发酵剂。奶酪次级微生物卡门培尔干酪、Brie干酪Penicilliumcamamberti丹麦蓝霉奶酪Danablu和Mycella，Brie娄地青霉P.roqueforti蓝纹奶酪blue-veinedcheeses白地霉GeotrichumcandidumSwiss,EmmenthalandGruye´recheeses薛氏丙酸杆菌,与成熟有关的细菌与成熟有关的细菌很多，包括：非发酵剂乳酸菌,小球菌,明串珠菌和肠球菌。微球菌和葡萄球菌(如变异微球菌,木糖葡萄球菌)棒状菌和短杆菌(如扩展短杆菌)丙酸杆菌(如薛氏丙酸杆菌和费氏丙酸杆菌)不同的肠细菌有时还会有腐败菌如梭菌(酪丁酸梭菌),大肠菌群和杆菌或病原菌如沙门、单增李斯特和大肠杆菌。,与成熟有关的细菌其它微生物酵母对成熟有非常重要的作用，虽然现在对其具体作用还不清楚。优势种群包括汉逊得巴利酵母，解脂耶氏酵母和马克斯克鲁维酵母。汉逊得巴利酵母有杀菌作用，在NaCl存在时效果更好。细菌素：已发现瑞士奶酪中费氏丙酸杆菌产的和蓝纹奶酪中抑制坚强肠球菌的细菌素。在成熟过程中，对微生物生长影响最大的内在因素是水分、盐含量、pH和氧。且这些指标随凝乳的部位和成熟的时间变化。表面：短杆菌、微球菌、汉逊得巴利酵母、解脂耶氏酵母、霉菌；内部：发酵菌如LAB和马克斯克鲁维酵母,Biochemicalreactionsofthematurationmicroflora发酵残留的乳糖，蛋白和脂肪的酶降解。但这些活动受内部特性如pH等的影响。青霉菌及酵母菌如汉逊得巴利酵母和解脂耶氏酵母有很强的乳酸利用能力，特别是在凝乳表面，导致其pH随时间增加。一些种类的微生物的蛋白水解活动也有助于酸度的降低，使pH从成熟开始的不足5.0增加到成熟后期和零售期的接近中性。因此，在开始时因低pH不能生长的细菌种类现在可以生长了。包括腐败的梭菌和病原菌如E.coli和L.monocytogenes.,成熟期死亡细胞的作用微生物的营养源：蛋白和脂肪分解产生的AA和甘油，微生物自溶的产物。酶：死亡微生物释放出的有活性的酶对生化反应有重要作用。成分的变化：凝乳中环境不同，微生物细胞中成分会有变化。如为应对盐压力，酵母会积累高浓度的甘油，而细菌通常会产氨基酸。,Summary在成熟奶酪的零售过程中，大多数的奶酪会有许多不同的微生物繁殖。奶酪的性质、货架寿命和安全受这些微生物的组成和变化的影响。掌握微生物生态的信息，可促进有益微生物繁殖，预防有害微生物的生长。分子生态学技术。,MicrobialdynamicsofCastelmagnoPDO,atraditionalItaliancheese,withafocusonlacticacidbacteriaecology三批传统的CastelmagnoPDO奶酪中优势微生物在生产和成熟过程中的动力学。收集制作过程中的不同样品，奶、凝乳和奶酪，进行依赖于培养技术和不依赖于培养技术的分析。传统的平板培养鉴定法分析鉴定LAB，和利用PCR-DGGE技术对16SrRNA基因中V1区进行分析。同时对样品中的有机酸、糖和酮用HPLC进行分析。InternationalJournalofFoodMicrobiology122(2008)302–311,MicrobialdynamicsofCastelmagnoPDO,atraditionalItaliancheese,withafocusonlacticacidbacteriaecology在所有生产阶段LAB是优势菌，尽管肠球菌、凝固素阴性葡萄球菌和酵母同样数量较大。在该奶酪制作过程中乳酸乳球菌乳酸亚种是分离最多的微生物，而植物乳杆菌和干酪乳酸杆菌在成熟期的样品中含量最高。偶尔会有德氏乳杆菌乳酸亚种、棒状乳杆菌扭曲亚种和干酪乳杆菌被分离出来。依赖于培养技术的分析结果和DGGE的分析结果部分相同，所以本研究再次突出了结合不依赖于培养技术的分子手段与传统方法对复杂食品环境进行研究的重要性。InternationalJournalofFoodMicrobiology122(2008)302–311,MicrobialcountsofmainmicrofloraduringmanufactureandripeningofCastelmagnoPDOcheeseMesophilicaerobicbacteriaonPlateCountAgarMesophilicandthermophiliccoccionM17MesophilicandthermophiliclactobacillionMRSEnterococcionKanamycinAesculinAzideCoagulase-negativecoccionMannitolSaltAgarColiformsonVioletRedBileLactoseAgarYeastandmouldsonMaltAgarsupplementedwithtetracycline(1μg/ml),NumberofisolatesofLABspeciesfoundinsamplesIdentificationofLABisolateswascarriedoutbycombiningPCR16S–23SrRNAgenespaceranalysis(RSA),FrequencyofisolationofLABspeciesthroughout3productionsPrevalenceofLABspeciesamongisolatesrandomlyselectedonM17agarandMRSagarplates乳酸乳球菌乳酸亚种Ch3S:cheeseafter3dayssalting植物乳杆菌和干酪乳酸杆菌,DGGEprofilesofPCRproductsofthebacterialV1regionofthe16SrDNAofsamples变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。,Chemicalcompoundconcentrations乳酸代谢、乳糖消耗与LAN的生长趋势高度一致，葡萄糖和半乳糖的代谢亦是如此。,Microbialecologyoffoodcontactsurfacesandproductsofsmall-scalefacilitiesproducingtraditionalsausages对7个小规模加工厂生产的传统发酵和/或干燥香肠的微生物状况进行了研究。显示加工环境的卫生状态和设备在微生物的稳定性和终产品的安全方面作用显著。研究表明在多数取样点(控制点)被腐败菌(如假单孢菌和肠细菌)严重污染(>4logCFU/cm2)，刀具、台面和切碎机表面污染最为严重。单核增生李斯特菌、沙门氏菌和金黄色葡蔔球分别在11.7%、26.4%和11.7%的食品接触表面被检出。在设备取样点，这些病原菌的存在往往伴随着一种或多种杂菌‘house-flora’的大量存在。然而，大量的杂菌并不一定意味着存在病原菌。FoodMicrobiology25(2008)313–323Greece,Microbialecologyoffoodcontactsurfacesandproductsofsmall-scalefacilitiesproducingtraditionalsausages产品样品和斩拌样品已经被加工设备表面的杂菌严重污染，然而终产品中LAB仍是优势菌。斩拌样品中发现少量的S.aureus和Salmonella，但终产品中的栅栏可以抑制或消除这些病原菌(aw<0.92,平均pH<5.0和天然菌的抑制);然而，在7个终产品中有3个检测到L.monocytogenes说明产品存在交叉污染。结果表明小规模加工设备的卫生状况不佳可能导致微生物控制的失败。,SimplifiedpredictionofStaphylococcusaureusgrowthinacookedmeatproductexposedtochangingenvironmentaltemperaturesinwarmclimates餐馆熟食会在橱窗里，在室温下展示数小时。一些食品会在不是很卫生的条件下加工，并在室温下贮藏很长时间。因为每天的气温是不稳定的，食品产品将会贮藏于温度变化的环境中，因此固定温度的预测模型用处不大。,FoodborneSalmonellaecologyintheaviangastrointestinaltract.Anaerobe15(2009)26–35.GastrointestinalmicrobialecologyandthesafetyofourfoodsupplyasrelatedtoSalmonella.JAnimSci2008.86:163-172.,细菌计数的标准稀释物是()A.生理盐水B.灭菌蒸馏水C.0.1%的蛋白胨D.磷酸缓冲液C,死亡细胞对食品微生物生态学的影响主要来自()A.微生物自溶的产物；B.利于形成菌膜；C.对pH的影响；D.释放出的有活性的酶。AD,对食品微生物生态的传统研究方法中，有局限性的技术步骤不包括()A.稀释；B.富集培养；C.微生物原地定位；D.平板计数。C,下列食品的不同部位微生物生态没有区别的是()A.切割后的果蔬和保留完整果皮或蜡层的果蔬表面;B.奶酪的表面和内部;C.无菌真空包装的小块肉制品的表面和内部；D.生菜叶的外表面和气孔内部。C